한강 바이러스에서 새로운 항생제 내성 효소 발견
의학약학 한국연구재단 (2020-06-09)
세균을 숙주로 삼아 기생하는 바이러스인 파지(bacteriophage)에서 항생제를 무력화시키는 새로운 항생제 내성 유전자가 밝혀졌다.
환경에 존재하는 비배양성 파지도 항생제 내성 전파의 매개체가 될 수 있는 만큼, 항생제의 직접 표적인 세균 뿐 아니라 세균에 기생하는 파지에 대한 모니터링 필요성에 대한 논의의 물꼬가 될 것으로 기대된다.
한국연구재단은 조장천 교수(인하대), 문기라 박사(인하대), 이상희 교수(명지대), 차창준 교수(중앙대) 등이 한강에 존재하는 파지에서 항생제 내성의 원인이 되는 유전자를 동정, 한강 바이롬 베타락탐 분해효소(HRV) 등으로 명명했다고 밝혔다.
이 유전자는 기존 슈퍼박테리아에서 발견되는 베타락탐 분해효소 유전자와 분해활성을 나타내는 핵심서열은 동일하지만 나머지 부분의 연관관계가 매우 낮은 새로운 분해효소여서 한강바이러스효소를 뜻하는 새로운 이름을 붙였다는 것이다.
연구팀은 한강 표층수를 채취, 세균을 제거하고 바이러스만 농축했다. 핵산 추출을 통해 130만개의 염기서열 조각을 얻었고 이 가운데 25개의 항생제 내성 유전자를 찾아냈다.
베타락탐 분해 핵심서열을 지닌 4개의 파지 유래 유전자가 실제 유효한 분해효소를 만드는지 대장균에서 해당 유전자를 발현하였다.
그 결과 해당 대장균은 여러 베타락탐계 항생제에 내성을 보여 파지에 존재하는 광범위 베타락탐 분해효소임을 확인하였다.
페니실린, 세팔로스포린 등 널리 쓰이는 베타락탐계 항생제에 살아남는 세균은 항생제 내성유전자의 하나인 베타락탐 분해효소 유전자를 가져 항생제의 베타락탐 고리를 분해, 항생제를 무력화한다.
세균은 접합 또는 파지의 감염과 같은 수평이동을 통해 다른 세균으로부터 항생제 내성 유전자를 얻는 것으로 알려져 있었고,
환경에 존재하는 일부 바이러스에서 이러한 항생제 내성 유전자가 보고된 적은 있지만 실제 베타락탐 분해활성을 가진 기능성 유전자는 아니었다.
연구팀은 숙주세균의 배양이 어려워 파지를 분리, 배양하기 어려운 만큼, 환경 내에 있는 파지의 유전자를 직접 분석할 수 있는 바이러스 메타유전체(바이롬, Virome) 분석방법을 사용하였다.
바이러스 유전체의 서열을 대용량으로 확보하고 항생제 내성 유전자의 활성 확인을 통해 환경 바이러스 중에서는 최초로 활성이 있는 항생제 내성 유전자를 발견한 것이다.
향후 이 항생제 내성 유전자가 실제 병원성 세균에 전달될 수 있는지 숙주세균에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 보인다.
연구팀은 파지 유래 항생제 내성 유전자가 존재하고 전파가능성을 배제할 수 없는 만큼, 항생제 내성 유전자 이동을 추적하기 위해 파지 유전체에 대해 모니터링할 필요가 있다고 설명했다.
과학기술정보통신부와 한국연구재단이 추진하는 선도연구센터지원사업과 환경부 환경기술개발사업 등의 지원을 받은 이번 연구의 성과는 국제학술지 마이크로바이옴(Microbiome)에 6월 1일에 게재되었다.
주요내용 설명
논문명
Freshwater viral metagenome reveals novel and functional phage-borne antibiotic resistance genes
저널정보
Microbiome, https://doi.org/10.1186/s40168-020-00863-4
주요저자
조장천 교수(교신저자, 인하대학교), 이상희 교수(공동교신저자, 명지대학교), 문기라(제1저자, 박사연구원, 인하대학교), 차창준 교수(공동저자, 중앙대학교)
< 연구의 주요내용 >
1. 연구배경
○ 1928년 페니실린의 발견 이후 항생제는 감염성 세균 질환의 대표적인 치료제로 사용되었다. 항생제는 병원성 세균에 감염된 수많은 사람의 목숨을 살렸지만, 오남용으로 인해 항생제 내성(耐性) 세균이 계속 출현하는 것이 큰 문제가 되어왔다. 지속적으로 새로운 항생제를 개발하였으나 여러 항생제에 동시 다발적으로 내성을 갖는 슈퍼박테리아가 등장하며 항생제 치료법은 큰 어려움을 겪고 있다.
○ 여러 계열의 항생제 중 페니실린, 세팔로스포린, 카바페넴과 같은 베타락탐계 항생제는 전 세계적으로 가장 많이 사용되고 있으며, 특히 카바페넴은 그람음성 병원균 치료의‘마지막 보루’라고 여겨지는 항생제다. 베타락탐계 항생제에 저항성을 나타내는 세균은 베타락탐 분해효소(β-lactamase)를 이용하여 항생제에 있는 베타락탐 고리를 분해함으로써 항생제를 무력화시킨다. 베타락탐 분해효소는 항생제에 노출된 병원성 세균에서 자주 발견되며 심지어는 항생제에 노출된 적이 전혀 없는 환경의 미생물에서 발견되기도 한다.
○ 농축수산업에 활용되는 동․ 식물과 강, 바다, 하천 등 자연환경에서 항생제 내성 유전자가 전파되므로 사람, 동물, 식품, 환경을 하나의 단위로 간주하여 항생제 내성 문제를 해결하려는 이른바 원 헬스(One-health) 기반 항생제 내성 종합관리가 전 세계적인 추세이다.
○ 병원균의 항생제에 대한 저항성은 항생제 내성 유전자의 유무에 따라 결정된다. 항생제 내성 유전자는 기존 유전자의 돌연변이에 따라 발생하기도 하며 인접한 세균에게 유전자를 전달해 주는 수평적 유전자 이동에 의해 여러 세균에게 전파되기도 한다.
○ 박테리오파지(파지)는 세균을 감염하는 바이러스로, 지구상에 가장 많은 수로 존재하는 생물학적 실체이다. 특히 강, 바다와 같은 물환경에 존재하는 바이러스의 90% 이상은 파지이다. 파지는 세균에 감염하여 숙주 세균의 유전자를 우연히 습득한 후 다른 세균에게 전달한다. 때문에 학자들은 파지가 세균의 항생제 내성 유전자를 습득, 이를 다른 세균에게 전파할 수 있다고 생각해 왔다.
○ 파지를 연구하기 위해서는 분리와 배양이 필수적이지만 파지의 숙주 세균의 배양이 어려워 파지 연구에는 제약이 많다. 따라서 파지를 배양하지 않고 환경 내에 있는 유전자를 직접 분석할 수 있는 바이러스 메타유전체(바이롬, Virome) 분석방법이 최근 전 세계적으로 사용되고 있다.
○ 최근 국제연구결과, 바이러스 메타유전체에서 발견되는 항생제 내성 유전자는 그 기능이 없는 것으로 드러나 파지 유전체에서는 항생제 내성 유전자가 선택되지 않는다는 의견이 비중 있게 제시되었다.
○ 이에 조장천 교수 연구팀은 대용량의 환경바이러스 유전체를 조사하면 실제 기능성이 있는 항생제 내성 유전자를 바이러스에서 발굴할 수 있을 것이라는 전제 하에 연구를 진행하였다.
2. 연구내용
○ 항생제 내성 유전자 전달 경로 중 하나인 파지 감염을 통해 전파되는 항생제 내성 유전자를 모니터링하고 추적하기 위하여 우리나라 대표적 도시하천인 한강의 6개 지점에서 각 10리터의 표층수를 채취하여 세균을 제거한 후 바이러스만 농축하였다.
○ 농축한 바이러스에서 핵산을 추출한 다음, 차세대 염기서열 분석방법을 사용하여 바이러스 메타유전체(바이롬)의 염기서열 정보를 얻었다. 바이롬 분석법은 아직까지 배양되지 않아 그 존재가 알려지지 않은 많은 양의 파지 유전자를 대용량으로 분석할 수 있는 방법이다.
○ 한강 바이러스 메타유전체 분석으로부터 약 130만개의 조립된 유전자 조각을 얻었으며 여기에서 25개의 다양한 항생제 내성 유전자를 발견하였다. 25개의 항생제 내성 유전자는 베타락탐, 폴리믹신, 반코마이신 등 항생제에 내성을 보이는 유전자이며, 파지 유전체 내에 존재하는 것으로 확인되었다.
○ 한강 바이러스 유전체에서 발견된 항생제 내성 유전자 중 4개의 유전자는 가장 자주 발견되는 항생제 내성 유전자인 베타락탐 분해효소 유전자로 판명되었다. 이들 유전자의 염기서열을 계통발생학적으로 자세히 분석한 결과 유전자 내에 효소의 활성화 자리가 잘 보존되어 있으며, 지금까지 보고된 어떤 베타락탐 분해효소 유전자와도 연관관계가 매우 낮다는 사실이 확인되었다.
○ 파지 유전체에서 발견된 베타락탐 분해효소 유전자를 대장균에서 발현시켜 항생제 내성을 실험한 결과, 페니실린, 세팔로스포린, 카바페넴 등의 베타락탐계 항생제에 대하여 대조군에 비해 최대 16배 강한 내성을 보이는 것이 입증되었다. 특히 그람음성 병원균 치료의‘마지막 보루’라고 여겨지는 항생제인 카바페넴계 항생제에도 저항성이 나타나서 광범위 내성 유전자로 확인되었다.
○ 이 유전자는 환경에 존재하는 비배양성 바이러스에서 발견되어 기능이 입증된 최초의 항생제 내성 유전자이다. 따라서 이들 유전자의 생산물인 베타락탐 효소를 각 항생제 내성 기작에 기초하여 HRV-1(한강 바이롬 베타락탐 분해효소-1; Han River Virome β-lactamase-1)과 HRVM-1(한강 바이롬 메탈로베타락탐 분해효소-1; Han River Virome Metallo-β-lactamase-1)으로 명명하였다.
○ 한강에서 동시에 수행한 세균의 메타유전체에도 HRV-1과 HRVM-1의 유전자가 발견되었으며 이는 항생제 내성 유전자를 가진 파지가 한강 생태계 내에서 활발하게 숙주 세균을 감염하고 있음을 나타낸다.
○ HRV-1과 HRVM-1 효소를 가진 파지의 유전체는 지금까지 보고되지 않은 새로운 염기서열을 가지고 있어서 이들이 감염하는 숙주 세균의 정체를 확인하기가 어렵다. HRV-1과 HRVM-1 효소는 미지의 파지에 의해 운반되어 불특정 세균에게 전파될 수 있는 가능성이 있어 신규 항생제 내성 유전자가 병원성세균에 전파될 가능성을 염두에 두고 지속적인 모니터링 연구가 필요하다.
○ HRV-1과 HRVM-1유전자를 이용하여 전 세계 각지에서 수행된 바이롬 데이터 내 유사한 유전자를 탐색한 결과, 미국 콜롬비아 강에서 HRV-1과 유사한 유전자를 발견하였고 싱가포르의 강에서는 HRVM-1과 유사한 유전자를 발견할 수 있었다. 따라서 HRV-1과 HRVM-1유전자는 우리나라 수환경에만 국한된 것이 아니며 국외의 수환경에서도 발견되는 항생제 내성 유전자로 확인된다.
3. 연구성과/기대효과
○ 이 연구를 통해 환경바이러스 메타유전체에서 활성이 있는 신규 베타락탐 분해효소인 HRV-1과 HRVM-1을 최초로 발견하였고 이들이 카바페넴 등 광범위 베타락탐 항생제에 내성을 나타내는 것을 입증하였다.
○ 환경에 존재하지만 배양되지 않은 바이러스에서 항생제 내성 유전자가 발견되어 그 기능이 입증된 것은 처음이며, 특히 물환경의 바이러스에서도 기능성 광범위 항생제 내성 유전자가 존재하는 것이 실험적으로 입증된 점이 중요하다.
○ 이번 연구를 통해 원 헬스 기반의 항생제 내성 유전자 모니터링을 위하여 병원성 세균뿐만 아니라 이들에 감염하는 바이러스에 대한 모니터링도 필요하다는 사실이 확인되었다.
○ 새로운 항생제 내성 유전자를 가진 바이러스가 세균에 활발하게 감염되는 것이 실험적으로 예측되었으므로 이후 미지의 숙주 세균을 밝혀내어 항생제 내성 유전자의 이동경로를 파악해야 할 것이다.
(그림 1) 신규 항생제 내성 유전자를 가진 한강 바이러스 유전체 탐색 모식도
(설명) 한강의 6개 지점에서 물 10리터를 채수하여 바이러스를 농축하고 DNA를 추출하였다. 차세대 염기서열 분석법을 사용하여 바이러스 메타유전체(바이롬)를 해독하고 약 3천만개의 DNA 조각을 확보한 다음, 최종적으로 130만개의 바이러스 유전체 조각을 얻었다.
이 중 베타락탐 고리를 끊는 베타락탐 분해효소 유전자로 1차 판정된 유전자를 대장균에서 발현시켜 항생제 내성 활성을 확인하였더니 페니실린, 세팔로스포린, 카바페넴 등과 같은 베타락탐 계열의 항생제에 대하여 내성을 보였다. 계통분석 결과 유전자의 신규성이 입증되어 한강바이롬 베타락탐 분해효소를 뜻하는 HRV로 명명하였다.
출처 : 인하대학교 생명과학과 조장천 교수 제공
(그림 2) 신규 베타락탐 분해효소의 대장균 발현을 통한 최소저해농도 확인
(설명) 한강 바이러스 유전체에서 발견된 HRV-1과 HRVM-1 유전자를 대장균에 발현시킨 후 다양한 베타락탐계 항생제를 투여하여 대장균의 성장을 저해할 수 있는 항생제의 최소저해농도(MIC)를 측정하였다.
대조군(회색)에 비해 HRV-1(파란색)과 HRVM-1(빨간색) 모두 페니실린계, 세팔로스포린계, 모노박탐계, 카바페넴계 항생제에 대해서 저항성을 나타냈으며 항생제 저항성이 최대 16배 증가되었다. 특히 카바페넴계 항생제는 다제내성 세균 감염에 대한 마지막 수단의 치료제로 알려져 있다.
출처 : 인하대학교 생명과학과 조장천 교수 제공
연구 이야기
<작성자 : 인하대 조장천>
□ 연구를 시작한 계기나 배경은?
환경에 존재하지만 배양이 되지 않는 세균과 바이러스에 대한 연구를 지난 20여 년간 수행해 오면서 이들 미생물에 어떠한 기능이 있을까에 대한 연구에 흥미가 생겼다. 최근 정부의 각 부처에서 항생제 내성 문제를 해결하기 위하여 원헬스(One-Health) 기반의 연구를 수행하는데 바이러스에 대한 접근이 부족한 것 같아 항생제 내성 유전자의 전달자로서 바이러스의 역할에 주목하며 연구를 시작하게 되었다. 연구를 시작하는 데는 중앙대학교 차창준 교수 연구팀의 항생제 내성체 연구 참여 권유가 결정적이었다. 최근 주요 국제 저널에 발간된 연구논문들이 ‘바이러스 유전체에서 발견되는 항생제 내성 유전자는 기능이 없다’라는 사실을 보고하고 있어서 이에 반대되는 증거를 찾고 싶다는 욕심도 연구를 시작한 중요 계기이다.
□ 연구 전개 과정에 대한 소개
환경 연구의 시작은 시료의 채취다. 중앙대학교 차창준 교수 연구팀이 한강에서 세균에 존재하는 항생제 내성 유전자를 연구하고 있었기에 여기에 참여하여 바이러스 시료를 한강수계에서 채취하였다. 한강 바이러스 유전체를 대량으로 분석하기 위해 한강의 6개 장소에서 10리터의 물을 채집하여 바이러스를 농축하였다. 바이러스에 있는 DNA의 양이 워낙 적어 DNA를 최대한 농축하여 추출한 다음 차세대 염기서열분석법을 사용하여 약 3천만개의 서열가닥을 얻었고, 이 중 1만개 이상의 염기서열로 구성된 바이러스 유래 130만개의 유전체 가닥을 확보하였다. 이 유전체 가닥을 생물정보학적 처리과정을 통해 분석한 결과 항생제 내성 유전자가 바이러스 조각에서 발견되었다. 바이러스 유래 항생제 내성 유전자가 활성이 있는지 분석하는 것은 명지대학교 이상희 교수 연구팀에서 수행하였으며, 대장균에서 발현한 결과 항생제 내성이 확인되었다. 분자계통학적 연구를 통해 이 유전자에 새 이름을 붙일 필요성이 제기되어 한강에서 발견된 바이러스 효소라는 의미의 HRV, HRVM라는 새 이름을 붙이게 되었다.
□ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소는 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?
파지 유전체에서 발견되는 항생제 내성 유전자 대부분은 기존에 알려진 항생제 내성 유전자와는 매우 다른 유전자 염기서열을 갖고 있어서 유전자 분석만으로는 이들이 실제로 항생제 내성을 갖는지 판단하기 어렵다. 따라서 외국의 많은 연구진들도 파지 유전체에서 발견되는 항생제 내성 유전자의 진위여부에 대해 의심을 계속해 왔다. 우리 연구팀은 파지 유전체에서 얻은 항생제 내성 유전자를 합성하여 대장균에 발현 시킨 후 항생제에 대한 감수성 실험을 수행하여 파지의 항생제 내성 유전자가 실제로 작동하는 것을 간단하게 증명하였다. 또 하나 어려웠던 점은 메타유전체 연구의 경우 대용량의 컴퓨터 서버가 필요한데 연구실의 생물정보학적 연구 인프라가 미흡한 것이었다. 이를 위해 전 세계의 분석 서버에 흩어져 있는 분석 툴을 분산하여 사용하고 종합하였다. 전 세계 과학자들의 연구 성과와 이를 공유하는 학계 분위기가 이 연구를 성공으로 이끈 숨은 원동력이라고도 할 수 있다.
□ 이번 성과, 무엇이 다른가?
지금까지는 전 세계적으로 항생제 내성 유전자에 대한 연구는 세균을 중심으로 이뤄져 왔다. 인체, 동물, 환경에서 세균을 분리한 다음 이 세균에 항생제 내성 유전자가 존재하는지 평가하는 것을 비롯하여 세균 메타유전체에서 항생제 내성 유전자를 탐색하는 것이 연구의 주된 관심사였다. 세균감염 바이러스인 파지가 항생제 내성 유전자를 여러 세균들에게 전파할 가능성은 오랫동안 제기되어 왔지만 실제로 해독된 파지 유전체 내에서 발견되는 항생제 내성 유전자가 거의 없고, 이마저도 기능이 없는 것으로 나타나 파지 유전체는 활성이 있는 항생제 내성 유전자를 가질 수 없다고 많은 학자들이 평가해 왔다. 그러나 이번 연구에서는 대용량 바이러스 메타유전체의 해독과 생물정보학적 탐색을 통해 바이러스 유전체 안에 있는 항생제 내성 유전자를 찾았으며, 이 유전자를 발현시켜 실제 이들이 기능이 있는 유전자임을 입증하였다. 특히 지금까지 전혀 보고되지 않았던 새로운 서열의 베타락탐 분해효소를 발견하였고, 이들 유전자가 그람음성 병원균 처리에 최후의 보루라 여겨지는 카바페넴계 항생제에 내성을 보여 만약 이 유전자가 병원성 세균에 전달되면 보건학적 문제를 일으킬 수 있는 위험요소임이 제기되었다. 바이러스 메타유전체에서 기능이 입증된 항생제 내성 유전자가 발견된 것은 이번 연구가 최초이다.
□ 실용화된다면 어떻게 활용될 수 있나? 실용화를 위한 과제는?
이번 연구를 통해 파지의 유전체 내에 신규 항생제 내성 유전자가 존재하며 이들이 발현하면 광범위 항생제에 내성을 보인다는 사실이 입증되었다. 따라서 항생제 내성 유전자의 이동경로 모니터링을 위하여 세균 유전체뿐만 아니라 파지 유전체도 모니터링 대상으로 선정하여 지속적인 관리가 필요하다는 점이 제기된다. 아울러 폐수처리 공정에서 바이러스 유래 항생제 내성 유전자의 처리에 대한 기술적, 정책적 대안도 모색해야 할 것이다.
□ 꼭 이루고 싶은 목표나 후속 연구계획은?
이번 연구에서 비록 세균감염 파지에서 활성이 있는 항생제 내성 유전자 발견되었지만 ‘왜?’라는 질문에 대해서는 접근도 못했다. 바이러스는 진화적으로 무슨 이득이 있기에 항생제 내성 유전자를 유전체에 가지고 있을까? 이 질문에 대한 답을 찾는 것을 이 연구의 목표로 삼고 싶다. 단기적으로는 이번에 발견된 파지 유전체에 있는 퀴놀론계 항생제 내성 유전자 등 여러 유전자의 발현과 특성 연구를 통해 다양한 신규 항생제 내성 유전자를 탐색하는 연구를 진행할 계획이다. 상대적으로 항생제에 노출이 많은 폐․하수처리장, 양식장에서는 더 다양한 종류의 바이러스 유래 항생제 내성 유전자가 존재할 것이라 예측되므로 대용량 바이러스 메타유전체 연구를 여러 환경에 확대할 계획이다.
출처: [BRIC Bio통신원] 한강 바이러스에서 새로운 항생제 내성 효소 발견
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